原理
采用競爭酶聯(lián)免疫分析法測定，在微量反應(yīng)板上預(yù)先包被二抗，它能特異地結(jié)合抗BNP抗體（一抗）的Fc片段，樣品或標(biāo)準(zhǔn)孔中的BNP與試劑中的生物素標(biāo)記的BNP競爭結(jié)合一抗的Fab片段。結(jié)合有生物素的復(fù)合物再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素結(jié)合，通過洗滌除去游離的生物素標(biāo)記的腦鈉肽及鏈親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物。酶催化四甲基苯胺（TMB）底物顯色，顏色深淺與標(biāo)本中的腦鈉肽（BNP）含量呈負相關(guān)。根據(jù)校正曲線，求得樣品中BNP的濃度。
20×濃縮緩沖液（50ml）
包被有二抗的微量反應(yīng)板（96孔）
封板膠（3張）
一抗（兔抗人BNP IgG）
BNP標(biāo)準(zhǔn)液（1μg）
生物素標(biāo)記人BNP段
鏈親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物（SA-HRP 30μl）
底物液（TMB 12ml）
終止液（2 mol/L 鹽酸15ml）
操作步驟
試劑準(zhǔn)備
1、稀釋緩沖液：用950ml蒸餾水稀釋50ml的濃縮緩沖液。
2、將腦鈉肽標(biāo)準(zhǔn)液用1ml稀釋緩沖液溶解，BNP濃度則為1000μg/l。用稀釋緩沖液稀釋成下列濃度：0.01、0.1、1、10、100μg/l。
3、分別用5ml稀釋緩沖液溶解一抗、生物素標(biāo)記人BNP肽段，搖勻。
4、取鏈親和素-辣根過氧化物酶結(jié)合物（SA-HRP）12μl加入到12ml稀釋緩沖液中，搖勻（用前稀釋）。
操作
在96孔微量反應(yīng)板上，設(shè)A1為空白對照，B1為總結(jié)合孔，C1到G1加系列標(biāo)準(zhǔn)品，其余孔加待測定血清樣品。
| 加入物（μl） | 空白孔 | 各標(biāo)準(zhǔn)孔 | 樣品孔 |
|---|---|---|---|
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | — | 50 | — |
| 待測樣品 | — | — | 50 |
| 一抗 | — | 25 | 25 |
生物素標(biāo)記人BNP | — | 25 | 25 |
| 封板，室溫孵育2h后，洗板6次 | |||
| SA-HRP | — | 100 | 100 |
| 封板，室溫孵育2h后，洗板6次 | |||
| 底物液 | 100 | 100 | 100 |
| 封板，室溫下孵育1h | |||
| 終止液 | 100 | 100 | 100 |
混勻，用酶標(biāo)儀在450nm波長處比色，用空白對照孔調(diào)零，測定各孔吸光度。
計算
在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制半對數(shù)坐標(biāo)校正曲線。由校正曲線求得樣品的濃度（μg/l）。
（江萊生物laibio.com）